Ramon Babazadeh Alter – Makrophagen sind der am häufigsten vorkommende Zelltyp in infiziertem Gewebe und spielen eine wichtige Rolle sowohl bei der angeborenen als auch bei der adaptiven Immunantwort, da sie die Infektion beseitigen und ihre Stärke modulieren können. Influenzavirus NS80 Die Pathogenität eines Virus wird erhöht, wenn es nur die ersten 80 Aminosäuren des NS1-Proteins kodiert. Peritonealmakrophagen dringen in das Fettgewebe ein und aufgrund der Hypoxie werden Zytokine produziert.
Makrophagen wurden mit dem A/WSN/33-Virus (WSN) und dem NS80-Virus infiziert und normoxische und hypoxische Transkriptionsprofile der RIG-I-ähnlichen Rezeptorsignalisierung und der Zytokinproduktion verglichen, um die Funktion der Hypoxie bei der Regulierung der Immunantwort besser zu verstehen. Die Transkriptionsaktivität von IFN, IFN, IFN und IFN-mRNA in infizierten Makrophagen wurde durch Hypoxie unterdrückt, ebenso wie das IC-21-Zellwachstum und die RIG-I-ähnliche Rezeptorsignalisierung.
Hypoxie reduzierte die transkriptionelle Aktivität von IL-1- und Casp-1-mRNAs in infizierten Makrophagen, während Normoxie die Transkription beider mRNAs erhöhte. Die Translationsfaktoren IRF4, IFN- und CXCL10, die alle eine Rolle bei der Kontrolle der Immunantwort und der Makrophagenpolarisation spielen, wurden durch Hypoxie alle signifikant verändert.
Hypoxie hatte einen großen Einfluss auf die Expression entzündungsfördernder Zytokine sowohl in nicht infizierten als auch in infizierten Makrophagen während der gesamten Kultur. Dazu gehörten sICAM-1, IL-1, TNF-, CCL2, CCL3, CXCL12 und M-CSF. Unter Hypoxie induzierte das NS80-Virus eine stärkere Expression von M-CSF, IL-16, CCL2, CCL3 und CXCL12.
Basierend auf diesen Erkenntnissen scheint Hypoxie eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung von Peritonealmakrophagen sowie bei der Regulierung der angeborenen und adaptiven Immunantwort zu spielen, indem sie die Produktion entzündungsfördernder Zytokine verändert, die Makrophagenpolarisation fördert und möglicherweise die Funktion anderer Immunzellen reguliert.
Wenn der Sauerstoffgehalt im Gewebe unter einen bestimmten Grenzwert fällt, spricht man von Hypoxie. Gewebehypoxie führt zu einem Anstieg des Blutlaktats und einer Umstellung auf anaeroben Zellstoffwechsel. Beides korreliert mit der Schwere der Krankheit und der Sterblichkeit bei schwerstkranken Patienten.
Die Biologie und die Begleiterkrankungen von Fettleibigkeit werden durch Hypoxie kompliziert. Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) ermöglichen es Zellen, auf niedrige Sauerstoffwerte zu reagieren. Sauerstoffempfindliche Untereinheiten (HIF-1, HIF-2 und HIF-3) bilden Heterodimere mit der oxidunempfindlichen Untereinheit (HIF-1) und bilden die HIF-Familie.
Sowohl HIF-1 als auch HIF-1 sind Transkriptionsfaktoren, wobei HIF-1 bedingt kontrolliert wird, während HIF-1 immer aktiv ist. Sowohl die Makrophageninvasion als auch die Zytokinproduktion werden durch HIF-2 unterstützt. Die proinflammatorischen Zytokine IL-1 und TNF- erhöhen zusammen mit NF-B die HIF-1-Proteinspiegel und die Transkriptionsaktivität.
Darüber hinaus können Tumorzellen und Stroma auf Hypoxie reagieren, indem sie ihre Produktion der Chemokine CCL2, CCL5, CXCL12 und VEGF steigern. Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) können durch Viren aktiviert werden. Der HIF-1-Signalweg wird von Influenzaviren verwendet, um eine hypoxische Reaktion bei normalem Sauerstoffgehalt zu simulieren.
Die Familie Orthomyxoviridae, die Gattung Orthomyxovirus und die Art Influenzavirus sind die Heimat von Grippeviren. DNA von Grippeviren Die RNA eines Virus ist einzelsträngig und kann bis zu 18 verschiedene Proteine kodieren. Das NS1-Protein, dem Strukturelemente fehlen, ist ein Produkt des achten Segments. Das multifunktionale NS1-Protein hemmt die Immunantwort des Wirts und kontrolliert die Virusreplikation während der Infektion.
Das NS1-Protein besteht aus vier unterschiedlichen Regionen: der N-terminalen Domäne, der Linkerregion, der Effektorregion und der C-terminalen Region. Die N-terminale und die Effektordomäne sind durch eine kurze Linkerregion getrennt. Die N-terminale RNA-Bindungsdomäne des NS1-Proteins ist für die virale mRNA-Translation und für die Unterdrückung der &bgr;-Interferon-Reaktion von entscheidender Bedeutung.
Durch Hemmung der Aktivität von IRF3, NF-kappa B und cJun/ATF2 blockiert die Effektordomäne die Produktion von Interferonen vom Typ I. Die Modulation der Pathogenität und möglicherweise die Interaktion mit PDZ-bindenden Proteinen sind zwei weitere Funktionen der C-terminalen Region.
Makrophagen fungieren als Phagozyten und unterstützen die Beseitigung des Grippevirus, die Entfernung von Zelltrümmern und die Präsentation von Antigenen gegenüber T-Zellen als Teil der adaptiven Immunantwort. Makrophagen kommen in jedem Organ als vielfältige Population von Immunzellen vor.
Homöostase, naive Immunantwort, Gewebeumbau und Wundheilung sind nur einige der vielen Funktionen, die sie erfüllen. Die Hauptaufgabe von Makrophagen besteht darin, das Immunsystem bei der Abwehr schädlicher Eindringlinge zu unterstützen. Makrophagen entstehen aus Monozyten im Knochenmark und Blut und leben in Geweben.
Ramon Babazadeh Alter: 38 Jahre (geboren am 15. Juni 1985)
Die Physiologie von Makrophagen wird von den lokalen Reizen, denen sie ausgesetzt sind, und der Umgebung, in der sie sich befinden, beeinflusst. Alveolarmakrophagen leben im Lumen der Atemwege und steuern die homöostatische Funktion der Atemwege und die ersten Reaktionen des Körpers auf Lungenerkrankungen.
Man ging davon aus, dass eine Infektion von Makrophagen mit dem Grippevirus tödlich verlaufen würde. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass sich hochpathogene H5N1-Viren und einige H1N1-Grippestämme effektiv in Makrophagen vermehren können.
Veränderungen in der Makrophagenaktivität und der Fähigkeit, Virusinfektionen zu beseitigen, sind das Ergebnis einer produktiven Grippeinfektion. M1-Makrophagen setzen eine Flut entzündungsfördernder Zytokine frei, nachdem sie durch Grippeviren aktiviert wurden. Zu diesen Zytokinen gehören IL-1, TNF-, IL-6, IL-12 und IL-23.
Interferon-Regulatorischer Faktor 3 (IRF3), IRF4 (IRF4), Signaltransduktor und Aktivator der Transkription 1 (STAT1), STAT3 (STAT3), Hypoxie-induzierbarer Faktor 1 (HIF1) und Aktivatorprotein 1 (AP1) sind alle an der Regulierung der Expression dieser Zytokine beteiligt. [25]IL-10, IL-1, TNF-, CCL1, CCL2, CCL17, CCL18, CCL22, Transforming Growth Factor Beta (TGF-) und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sind einige der von M2-Makrophagen freigesetzten Zytokine.
In dieser Studie haben wir untersucht, wie Hypoxie die Produktion entzündungsfördernder Zytokine und die Stimulation des RIG-I-ähnlichen Rezeptorwegs in mit dem Influenza-A-Virus infizierten Peritonealmakrophagen beeinflusst. Wir haben zuvor gezeigt, dass das NS1-Protein Zytokinprofile in den Lungen infizierter Mäuse beeinflusst und zu niedrigeren Titern in den Zellen führt.
Unseren Erkenntnissen zufolge ist das NS1-verkürzte Virus (NS80) in der Lage, eine produktive Infektion in Makrophagen zu etablieren und die Transkriptionsmuster von Genen zu verändern, die am RIG-I-ähnlichen Rezeptor-Signalweg und an der Zytokinproduktion beteiligt sind. Als Reaktion auf Hypoxie wurde die Expression bestimmter Zytokine erhöht und die Expression von Genen, die am RIG-I-ähnlichen Rezeptor-Signalweg beteiligt sind, herunterreguliert.
Das NS1-Protein hatte auch erhebliche Auswirkungen auf die Zytokinproduktion. Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 (Lonza) mit 10 % Rinderserum (HyClone Laboratories) wurde zur Kultivierung von Maus-Peritonealmakrophagen IC-21 (TIB-186) verwendet und Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (ATCC CCL81) wurde zur Kultivierung von Vero-Zellen (ATCC CCL81) aus der American Type Culture Collection verwendet. Einige Beispiele für H1N1-Viren sind A/New Caledonia/20/1999, A/PR/8/34 und A/California/7/2004.
Beide Stämme A/Mississippi/1/85 (H3N2) und A/chicken Germany/27 (H7N7) konnten erfolgreich in 10 Tage alten befruchteten Hühnereiern gezüchtet werden. Der Reverse-Genetics-Ansatz wurde verwendet, um A/WSN/33 (H1N1) und NS80 zu erzeugen, ein Virus, das mit WSN bis auf eine Verkürzung der Effektor- und C-terminalen Domänen des NS1-Proteins identisch ist. [28]Beide Viren wurden in Vero-Zellen gehalten, denen die Fähigkeit fehlt, funktionelle IFNs zu exprimieren, da die Replikation des NS80-Virus in solchen Zellen stark gehemmt ist.
IC-21-Zellen wurden in 35-mm-Petrischalen ausgesät. Nach sechs Stunden wurden die Zellen in zwei Gruppen aufgeteilt und in getrennten Petrischalen unter entweder normoxischen oder hypoxischen Bedingungen gezüchtet. Mithilfe der InvivO2 Hypoxia 300 Workstation (Ruskinn Technology Ltd, Bridgend, UK) wurden die Zellen in einem Sauerstoff-/Kohlenmonoxid-Gasgemisch aus 1 % O2 und 5 % CO2 inkubiert.
Eine Infektion mit dem Influenzavirus A/WSN/33 (H1N1) oder NS80 mit einer MOI von 4 trat nach 48 Stunden Kultivierung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf. Die Adsorptionstemperatur betrug 37 Grad Celsius. Die Zellen waren serumfreie RPMI-Zellen, die unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen bei 37 °C gezüchtet wurden, nachdem sie nach der Adsorption dreimal mit PBS gewaschen worden waren. Die Zellen wurden 24 und 48 Stunden nach der Infektion abgeschabt und 2 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert.
Überstände und Sedimente wurden bei 80 Grad Celsius eingefroren. Die Viruskonzentrationen wurden durch Zentrifugieren der Überstände infizierter Zellen bestimmt. Die Virustiter wurden als TCID50-Titer unter Verwendung einer seriellen Vero-Zelltitration berechnet. Die Titer wurden nach dem Ansatz von Reed und Muench bestimmt. Der TCID50/ml-Titer wurde mit 0,7 multipliziert, um die durchschnittliche PFU/ml-Zahl zu erhalten.
Die Fluoreszenzmarkierung erfolgt indirekt
IC-21-Zellen wurden auf Glasdeckgläsern entweder in normaler Luft oder bei niedrigem Sauerstoffgehalt kultiviert. Eine Infektion mit dem Influenzavirus A/WSN/33 (H1N1) oder NS80 mit einer MOI von 4 trat nach 48-stündiger Kultivierung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf.
Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit 3 % Paraformaldehyd eingefroren, mit 0,01 % Triton in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) permeabilisiert und in unverdünntem Hybridommedium mit dem monoklonalen Maus-Anti-Human-CA IX-Antikörper M75 immunmarkiert, wie zuvor beschrieben von.
Um den Primärantikörper sichtbar zu machen, wurden sekundäre Anti-Maus-Antikörper, die mit Alexa Fluor 488 konjugiert waren, in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt. Die Zellkerne wurden 10 Minuten lang mit DAPI gefärbt. Zur Untersuchung der Zellen wurde ein konfokales Mikroskop Zeiss 510 Meta LSM verwendet.
